张敏 李伯安邱广斌

选自中华检验医学杂志, 2017,40(07)

随着人类基因组计划在2003年彻底完成，基因测序技术不断发展，下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术也逐步成长为主流的测序技术，其测序原理的不断创新和技术的不断突破使得高通量的基因序列读取趋于个体化需求的应用，有望引领并取代常用的分子诊断技术。

一、NGS

NGS又称为高通量测序，包括二代的大规模平行测序和三代的单分子测序。二代测序包括了Illumina公司的Solexa测序平台、Roche公司的454测序平台和ABI公司的寡核苷酸连接检测平台(SOLiD)，不同平台测序方法不同，但原理有着共通之处，都是将基因组DNA随机切割成小片段DNA，再通过构建文库、PCR扩增等技术流程获得测序模板进行测序及数据分析，相对于Sanger测序来说通量高、速度快、费用低，但普遍存在读长较短的缺点。

三代测序以美国太平洋生物的单分子实时技术及英国牛津纳米孔公司的纳米孔单分子测序技术为主，特点是不需要进行PCR扩增，通过不同手段区分碱基信号差异，直接读取序列信息，其读长长、高通量，可以对RNA和甲基化DNA序列进行直接测序，目前还存在错误率高、成本较高和生物信息分析软件不够丰富等缺点。

二、NGS目前在感染性疾病上的临床应用

近年来，全球感染性疾病谱出现了新的变化，一方面疑难感染不断增多，传统诊断方法跟不上微生物不断进化和变异的节奏，另一方面传染病的传播速度明显加快，这些都为感染性疾病的诊疗带来了严峻挑战。对于感染病原体临床标本的快速检测诊断已经成为了临床上越来越迫切的需求，NGS技术以其速度快、准确率高、成本低等优点，在感染性疾病中发挥了越来越重要的作用。

1.在细菌感染检测中的应用:

临床上培养法是诊断细菌感染的标准，其耗时长，对技术要求高，某些细菌生长条件苛刻，更增加了培养成功的难度。NGS技术应用于细菌感染检测，不仅能够明确是否存在细菌感染，还可以直接对菌株进行分型，获得分子血清型、耐药基因谱等信息，分析其菌株进化历史、感染源及感染路径，有助于疾病预防、诊疗和疫苗研发等。

2011年5月以德国为中心，欧洲暴发了一次严重的出血性肠道感染，科学家对病菌菌株进行全基因组测序，发现致病元凶为致死性的大肠埃希菌O104:H4，通过对序列的分析推断其感染人体的途径和致病机制，溯源追踪了其感染路径，为疫病的诊断和治疗提供了重要信息[1]，同年6月法国也发生了类似感染，普遍认为德国菌株可能是感染源，且通过传统方法及分子诊断学方法测得两次暴发病原体完全一致，但NGS序列分析发现德国大肠埃希菌菌株基因多样性远低于法国菌株，由此确认其为法国暴发病原体的演化支，明确了感染源[2]。2013年欧洲再现散发的类似病例，菌株测序后发现新发病原体不同于O104:H4，但它们存在多种共同的致病基因区域，也有引起严重的暴发流行的可能，相关菌株的测序结果有助于建立有效的疾病预警[3]。

2011年美国国立卫生院发生了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌感染，虽有早期发现感染预防措施，仍导致18例患者被感染，11例感染者死亡，综合基因测序及流行病学分析追踪了其感染源及感染途径，促进了院内感染和传播的控制[4]。

由于基因变异和抗生素的广泛使用，越来越多的细菌出现了耐药菌株，其中结核杆菌耐药菌株培养难度高，时间长，临床检测受到极大限制。但作为一种低序列多样性的单基因型细菌，基因测序技术在检测其菌株毒力和耐药性上有着极大的优势，可以快速检测病原体感染及其耐药，随着技术的不断成熟和成本的下降，有望取代现有的培养和分子诊断法，也可以通过测序数据分析其传染过程中的分子进化速度和模式，对治疗和疫苗研发有深远的意义[5]。

2.在病毒感染检测中的应用:

病毒感染诊断以抗原抗体检测为主，PCR检测、DNA探针等分子诊断方法也有着普遍应用，NGS技术主要应用于基因型分析、耐药突变检测及病毒在宿主体内演化，以及暴发感染病毒的快速检测时以协助预防、诊断治疗及疫苗研究等方面。

乙肝病毒是导致肝炎、肝硬化和肝癌等慢性肝病的主要原因，病毒感染治疗常用核苷类抗病毒药物，具有毒副作用少、效果好等优点，但长期治疗存在病毒耐药突变的可能，耐药可引发病毒反弹和肝炎发作甚至肝脏失代偿、急性肝衰竭等严重情况，通过NGS对耐药基因位点进行检测，并及时根据耐药情况调整治疗方案，可以达到更好的疗效[6]。

文章来源：《下一代英才》 网址: http://www.xydbjb.cn/zonghexinwen/2020/1028/1141.html